拓展:中心法则与DNA复制、转录过程

中心法则

众所周知DNA双螺旋结构由沃森、克里克发现。其中克里克在发现DNA双螺旋结构后又提出了另一个新的模型,用来描述遗传信息在细胞内的传递方式,这就是中心法则。

图1:中心法则。

箭头指明了遗传信息的流动方向:从DNA到DNA,从DNA到RNA,从RNA到蛋白质。


(图1)中心法则的示意图中有三个箭头,由DNA指向自身的箭头代表了遗传信息可以从DNA流向DNA,即存储遗传信息的DNA是可以复制的。由DNA指向RNA的箭头代表了DNA储存的遗传信息可以转移至RNA中保存。由RNA指向蛋白质的箭头代表了RNA保存的遗传信息最终会以蛋白质的性质出现在细胞中并发挥作用。这三个过程分别叫做:DNA复制、转录和翻译

图2:中心法则的补充。

虚线箭头是特殊的、只存在于病毒中的遗传信息流动方式,RNA复制和逆转录。


当然这是对于细胞遗传信息的描述,随着时代的进步,研究的深入,科学家们逐渐关注了非细胞生物的遗传信息的流动方式,于是中心法则得到了一定的补充。(图2)这幅图相比上一幅图多出了两个虚线箭头,由RNA指向自身的箭头代表了在一些以RNA作为遗传物质的病毒中,它的RNA可以进行复制,例如烟草花叶病毒。由RNA指向DNA的箭头代表了另一些以RNA作为遗传物质的病毒中,它的RNA可以逆向转变为DNA,例如HIV病毒。当然,这些都是少数,而且只存在于病毒这样的非细胞生物中,所以它们并不是中心法则的重点。

DNA复制

图3:DNA中碱基的配对。

DNA中A、T配对,形成两个氢键。C、G配对形成三个氢键。


DNA之所以能够进行复制,其结构基础在于DNA双链内部的碱基互补配对。查戈夫规则指出,在DNA中A的含量等于T的含量,C的含量等于G的含量,这一点直接推动了DNA双螺旋结构搭建的原因正是它指出了碱基配对的方式。(图3)分子结构表明,在DNA中,碱基A与T,C与G之间各自有氢键的连接,同时连接后的二聚体有着相同的直径和较高的稳定性。这就意味着只要有DNA的一条链,就可以准确的得到另一条链的构成,这也是DNA准确复制的基石。

图4:DNA半保留复制的实验证明。


根据DNA的结构,沃森、克里克在发表关于DNA双螺旋结构的文章时已经猜想,DNA的复制或许是两条链分离,各自作为模板合成一条新链形成新的双螺旋。这种半保留复制的观点当时只是一种猜想,最终的实验证明由Meselson和Stahl于1958年完成。(图4)他们的实验使用同位素标记法,让DNA的亲代链全部带有15N标记,同时让亲代DNA在14N的环境中复制,复制后,离心处理,由于DNA链的质量不同,离心过程中不同质量的DNA会分离。实验发现,经过一次复制的DNA质量一致,没有分离,同时其质量均比亲代DNA小。经过两次复制后,产生了质量更小的DNA,与第一次复制的DNA质量相同的DNA同样存在。这一实验正式证明DNA半保留复制的正确性。

图5:DNA合成的方向性。

由于合成方式的限制,DNA的合成只能从5’端到3’端方向进行。


DNA复制首先需要将双链打开。完成这一过程的酶叫做解旋酶(helicase)。解旋酶通过水解ATP获得的能量打开DNA双链之间的氢键,同时会有单链DNA结合蛋白与分离的单链DNA结合以稳定这种分离的结构。DNA复制的核心结构是复制叉,DNA双链由解旋酶打开同时进行新链的合成会形成Y型结构,故名复制叉。DNA合成的核心酶是DNA聚合酶(DNA polymerase),DNA聚合酶可以催化一个核苷酸三磷酸脱去焦磷酸集团并连接在已有的DNA链末端(图5)。由于DNA的合成方式是脱去焦磷酸连接,这一点导致了DNA合成具有方向性,即DNA只能由5’-3’方向合成。

图6:前导链和后随链的复制方式。


DNA的结构告诉我们,DNA的两条链的方向是相反的,所以DNA整体向一个方向进行复制时,只有一条链可以连续复制,另一条链的方向不允许它连续合成DNA。这个过程中,可以连续复制的链叫做前导链(leading strand,另一条链叫做后随链(lagging strand。对于后随链的复制,复制时DNA每打开一段,DNA从复制叉的中心往回复制一次,如此形成一个一个的片段,称为冈崎片段。随后所有的冈崎片段之间由DNA连接酶(DNA ligase)连接成为一个整体。(图6)受限于DNA聚合酶的催化机理,DNA复制之前需要有一个已经与亲代DNA结合好的核苷酸为后续合成提供合成起点。由于单一的脱氧核苷酸无法与DNA单链有效的连接,此时需要DNA引发酶(DNA primase)在亲代DNA单链上合成一小段与之配对的RNA称为引物(primer,随后,引物就会被特定的酶移除。上述后随链的复制中,冈崎片段的产生也需要引发酶一次次合成引物为冈崎片段提供起点。

图7:复制叉的DNA复制复合体。


当然DNA在复制时的诸多过程并不是分离的,上述提到的酶、蛋白会在复制叉处形成一个大的复合体,如此多种酶协同工作,能过最大化的提高DNA复制的效率(图7)。

上述只是说了DNA复制中最核心的原理,在DNA复制中,也能够分为:起始、延长、中止三个阶段。核心原理仅仅是延长阶段的工作机理,起始和中止还另有奥妙。细菌的基因组就是它的拟核——一个大型的环状的DNA。在细菌的DNA上有一个复制起始位点,那是段富含A-T配对碱基的序列,由于A-T配对碱基之间只有两个氢键,想要打开这样的区域相对容易。细菌DNA开始复制时,会有启动蛋白,解旋酶,引发酶参与。启动蛋白寻找并结合在复制起点,使得DNA形成特殊三维结构,促进双链解开,同时解旋酶和引发酶进入双链打开的区域完成复制的准备工作。不过在细菌中,启动蛋白、解旋酶、引发酶分别叫做dnaAdnaBdnaG而在真核细胞中,基因组较大,因此复制起点会有很多,多个位置同时开始复制,这样会快很多。真核细胞中的复制起始首先需要ORC(origin recognition complex)蛋白与起始位点结合,同时招募解旋酶。当解旋酶开始工作后,继续招募复制所需的其他酶和蛋白开启复制。另外一点,真核细胞中DNA是以染色质形式存在,DNA缠绕着组蛋白形成核小体,这种结构是不利于DNA复制的。事实上,复制过程中,会有染色质重构复合体的存在,这个复合体会在复制叉前方留出600nt的没有组蛋白的区域,方便复制进行。同时,在复制叉的后面,组蛋白在组蛋白伴侣蛋白的诱导下在已经复制好的DNA上重新结合。

图8:端粒酶的工作方式。


对于真核生物DNA来讲,在它们线性的DNA末端有一段特殊的序列——端粒。端粒位于DNA的末端,由一段序列重复多次组成。DNA在复制过程中,由于DNA聚合酶的问题,后随链的末端可能无法形成冈崎片段,导致DNA复制缺失一段。这时,需要端粒酶辅助复制。端粒酶自身携带有一段RNA模板,可以延长亲代DNA的端粒,让后随链可以顺利形成冈崎片段完成复制(图8)。同时,端粒作为DNA的末端,容易受到一些酶的降解,导致DNA损伤,因此,端粒也会形成特殊的结构保护自身。

图9:端粒会形成环状结构进行自我保护。


由端粒酶的工作机理可以看出,DNA复制完成后亲代DNA链的末端会比子代DNA链长一点。由于端粒是特定序列的重复,多出来的序列会形成环状结构反向插入端粒双链区中一次保护末端的稳定(图9)。

细菌中还有一类特殊的DNA需要复制,那就是质粒——细菌中的小型环状DNA。质粒的复制与细菌拟核DNA的复制有所相似,最主要的方式叫做Theta(θ)复制,名字来源于复制时会产生类似于字母θ的结构。但是不同的是,质粒的复制最重要的地方在于要保持一定的数量。在复制中调控数量的方法也分几个类型。一类以ColE1为代表的复制形式,这种复制会产生一条长的RNA和一条短的RNA,当没有短RNA存在时,长RNA会与DNA复制起始位点相配对,为复制提供引物,当有短RNA时,两条RNA会在蛋白的诱导下相互配对形成双螺旋结构抑制复制开始。另一类以pSC101为代表的复制,在这种复制形式的质粒的复制起始位点两侧分别有RepA蛋白和DnaA蛋白的结合位点,同时两个蛋白可以相互结合。当两种蛋白同时结合在DNA位点上时,两种蛋白相互结合,促进两者之间的DNA片段解开双螺旋,以开始复制。还有一类以R6K为代表的复制,它会产生一种π蛋白,这种蛋白可以形成二聚体。当π蛋白较少时,它会以单体形式存在,此时该蛋白会促进复制开始。相反π蛋白较多时,蛋白会形成二聚体,这种二聚体可以抑制质粒的复制。

DNA转录

仅仅储存的信息是没有意义的。细胞的遗传信息不可能仅仅储存在DNA中或者随着DNA的复制而越变越多。DNA本身的特点和功能——稳定的双螺旋结构,用于存储信息——决定了DNA自身无法有效的充当那个能够将信息解读成为有效内容的载体。不过,这个过程在中心法则中已经有阐释,那就是其中的第二个箭头,从DNA到RNA——转录。


DNA与RNA的区别:

DNA中脱氧核糖作为核苷酸的戊糖,RNA中为核糖。DNA中有胸腺嘧啶T,RNA中相应的碱基会变成尿嘧啶U。


说到转录,先得说一下RNA。RNA和DNA一样都是核酸的一种。DNA全名叫做脱氧核糖核酸,RNA的全名叫做核糖核酸。从构成单位上来讲,DNA的核苷酸的戊糖是脱氧核糖,RNA的核苷酸的戊糖是核糖。DNA中有四种碱基A、T、C、G,RNA中也有四种碱基A、U、C、G(图10)。

图10:RNA具有多样的高级结构。


从结构上来讲,DNA是双链,两条链相互配对反向平行,形成规则的右手螺旋结构。RNA是单链,没有相互配对,但是经常会自身配对形成较为多样的三维结构(图10)。

图11:细胞中可以产生的RNA及其功能。


相比于DNA规则、稳定的结构,RNA较为短小的同时又具有多样的结构,这使得RNA具有多样化的功能。常见的RNA类型有mRNA、tRNA、rRNA,mRNA全名信使RNA,它的功能是将DNA上需要生成蛋白质的遗传信息从DNA上拷贝下来,为下一步的蛋白质合成提供模板。tRNA全名转运RNA,它的功能是携带特定的氨基酸,参与蛋白质的生物合成。rRNA全名核糖体RNA,它主要负责与特定的蛋白质结合组成核糖体。后续过程中,我们提到的转录其实应该是狭义上的转录,即细胞以DNA为模板 生成可为后续合成蛋白质提供信息的mRNA的过程。实际上,从广义来讲,转录可以泛指一切以DNA为模板生成RNA的过程,如生成tRNA、rRNA的过程均可称为转录。当然转录的产物不止这三类,通过转录产生的RNA种类多种多样,功能也各不相同,细胞需要他们在不同的地方发挥功能(图11)。


细菌的转录工作流程。


对于转录,原核细胞和真核细胞有着完全不同的体系,下面就将分别讲述。在原核细胞中,转录的起始需要RNA聚合酶全酶(RNA polymerase holoenzyme)的参与,它分为两个部分,RNA聚合酶核酶(RNA polymerase core enzyme)即RNA聚合酶还有σ因子(σ factor)。转录不同于DNA复制,DNA复制需要将DNA所有的部分复制下来,生成遗传信息完全一致的新DNA分子,转录则是需要将DNA中特定的一部分序列转录下来,因此识别序列是转录起始的重中之重。在原核细胞中,σ因子就起到了特异性识别序列的作用。转录开始前,σ因子和RNA聚合酶结合成为RNA聚合酶全酶,随后σ因子会寻找到DNA上需要转录的片段的起点,同时σ因子辅助RNA聚合酶打开DNA双链,形成复合体。一方面RNA聚合酶与DNA聚合酶催化机理相似,使用的原料不同而已。另一方面RNA聚合酶本身带有解旋酶活性,不需要像DNA聚合酶一样需解旋酶辅助打开双链。形成复合体后σ因子的作用发挥完成,并从全酶上释放下来,游离的σ因子则可以寻找其他的RNA聚合酶结合开启其他的转录。转录的中止同样受到特殊序列的调控。当转录需要终止时,DNA上的相对应的序列会是一系列可以相互配对的碱基如一系列A和一系列T。如此产生的RNA会自身配对,形成发卡结构,辅助已经转录完成的RNA脱离活性中心。

在真核细胞中,情况要复杂很多。原核细胞只需要一个σ因子辅助RNA聚合酶就可以完成转录起始,真核细胞则需要许多的转录因子(transcription factor,TF)的辅助。在真核细胞需要转录的DNA的前端有一段富含T、A碱基的序列,称为TATA box。开始转录时,会有转录因子TFIID识别TATA box,并与之结合。随后TFIIB与之结合,TFIIB的作用是招募后续需要的TFIIF和RNA聚合酶。TFIIF稳定前面已经形成的复合体,也能够招募TFIIE,TFIIE再招募TFIIH,TFIIH可以辅助DNA双螺旋解开。另外,在离TATA box较远的位置有一段序列叫做增强子(enhancer),这段序列上可以结合激活蛋白。同时已经形成的复合体上会结合一个中介子,转录准备开始时,激活蛋白会折过来与中介子接触,接触后复合体释放RNA聚合酶开始转录。


与原核细胞不同,真核细胞转录出的产物并不是可以直接用来翻译的mRNA。真核细胞的基因分为外显子和内含子,转录完成后,转录产物需要经过RNA剪接的过程,该过程可以将mRNA前体中的内含子序列剪除,将前后的外显子序列连接在一起。另外,产生的mRNA前体需要在5’端加上一个G cap,在3’端加上多聚A。经过RNA剪接和前后端的修饰,mRNA前体会成为成熟的mRNA,RNA剪接目的是完成完整的基因序列组合,前后端修饰为了防止mRNA过快的被降解,让mRNA可以充分的离开细胞核,到细胞质中发挥作用。


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